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        制片技术

        冷冻切片

        一、 恒温冷冻切片

        将组织在恒温冷冻切片机里切片。冷冻腔内的温度一般设置为-18至-25℃,根据不同组织调节不同

        的腔温,平时应将冷冻头放置于冷冻台上。冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。

        (1)、 当冰冻组织取好后,有速冻开关的机器可先将开关打开,再在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基

        纤维素(可用普通胶水代替),放上组织,速冻。

        (2)、 待组织冻结后,将冷冻头装到冷冻切片机

        (3)、 粗切,修出切面细切几张,用毛笔刷去刀上组织片

        (4)、 放下抗卷板,开始切片,切片厚度一般为5~6微米,切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇

        冰醋酸液(97ml甲醇+3ml冰醋酸)中固定,固定时间为10~20秒

        (5)、 水洗

        (6)、 苏木素1分钟

        (7)、 水洗

        (8)、 盐酸酒精分化1秒钟

        (9)、 水洗

        (10)、温水蓝化

        (11)、伊红2~5秒钟

        (12)、梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

        冰冻切片的注意事项:

        (1) 速冻:是冰冻切片的关键,因为只有速冻才能减少组织内的冰晶,最好的办法是将速冻头迅速压

        在组织上,冻好后就可切片。特别适用于较脆的组织。而含有脂肪较多的组织,最好放在液氮里处

        理。在液氮里冷冻要注意不要冻过头,2~3秒钟就要拿出来看一下,只要有4/5的组织已经冻住就可

        以了,待冷冻头拿出后刚好全部冻住,否则就会引起组织发脆,或冷冻头与组织分离。

        (2)固定:切片后应立即放入甲醇冰醋酸中固定,不能等切片干后再固定,后者容易造成细胞退变。

        固定液有很多种,根据我们的实践,认为甲醇作用快,收缩小,染色较清晰,是冰冻切片最理想的固

        定液, 而每97ml加入冰醋酸3ml,会减少某些胶质、钙质较多的组织不容易掉片。

        (3)包埋剂:可用普通胶水代替,但要加入适量的水(胶水与水的比例大约在2:1左右)。太稀了,

        容易损伤切片刀;太稠了,粘在切片上不容易洗掉,影响切片的质量。

        (4)冰冻用切片刀不仅要磨的快,而且要磨的直,否则切出的片子就不会平整,不能进入抗卷板。最好

        能使用一次性刀片。

        (5)如组织发脆,可等几分钟后再切,也可用手在组织上稍稍加温;如果用手去摸组织块,最好戴手

        套,或用玻片间的纸夹在手与组织之间,以防感染。

        (6)冷冻室的温度冬天一般设在-19℃左右,夏天设在-22℃左右。不同的组织,有不同的温度要求:肝

        脏、甲状腺组织温度控制在-15℃左右,脂肪组织一般在-35℃以下。

        (7) 冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态,经常的开关机器电源容易造成压缩机损伤。

        二、半导体制冷切片

        (1) 组织放置在半导体制冷台上,加少量水,调好切片的厚度

        (2) 接通循环流水后,再接通电源,在使用的全过程中不能中断流水,等电源关上后才能停水。并且

        正负极不能接反,用整流电源控制温度。冷冻组织周围的水不能过多

        (3) 待组织发硬到可切成厚薄一致的切片时,即可切片。切片厚度5~6微米,切片用毛笔展平后,立

        即放入甲醇冰醋酸液中固定,固定时间为1分钟

        (4) 苏木素1分钟

        (5) 水洗

        (6) 盐酸酒精分化1秒钟

        (7) 水洗

        (8) 温水蓝化

        (9) 伊红2~5秒钟

        (10) 梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

        三、二氧化碳冷冻切片

        a) 先将组织放入加热的20%甲醛溶液中固定1~2分钟,水洗(也可将组织不经固定直接放在切片机的

        冷冻台上)

        b) 放在切片机的冷冻台上,加少量水,打开二氧化碳开关,此时有二氧化碳气体喷出,待组织出现

        冷霜后,关闭二氧化碳

        c) 切片,切片厚度6~8微米,将切出的片子放于水中舒展,用镊子将组织平铺于载玻片上(如未固定

        组织的切片直接用载玻片粘贴,立即放入甲醇中固定2秒,然后进行染色,)

        d) 加热烤片,烤片温度不宜超过60℃,更不能将组织烤焦。

        e) 染色时将苏木素滴加在载玻片上,加热1分钟(60℃左右,不能将苏木素烧开,以防切片脱落)

        f) 水洗

        g) 盐酸酒精分化1秒钟

        h) 水洗,温水蓝化

        i) 伊红2~5秒钟

        j) 梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

        泰维科技 www.cungdanxua.com

        时  间:2021-07-26 17:20

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